一、研究背景與科學問題

二、實驗材料與方法

1. 細胞系

   ：人肺泡上皮細胞系 A549（CCL-185）、人肺成纖維細胞系 MRC-5（CCL-171），均購自 ATCC；A549 使用至第 25 代，MRC-5 使用至第 16 代以維持細胞特性，培養于含 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素 - 鏈霉素（P/S）的 DMEM 培養基，37℃、5% CO?恒溫培養箱中培養。

2. 細胞計數與活力檢測

   ：采用 Countess™3 自動細胞計數器結合臺盼藍排斥法，確保實驗起始細胞活力一致
   
   

1. Flexcell 張力系統參數

   ：采用 FX-6000 張力系統施加等雙軸應變，病理刺激參數為 18% 振幅、0.4Hz、持續 24h；對照組維持靜態培養，通過真空壓力使柔性膜圍繞固定柱變形，實現細胞均勻拉伸（圖 1）。

2. 免疫熒光分析

   ：固定（4% 多聚甲醛）、透化（0.2% Tween 20）后，用 Alexa Fluor™594 標記 ZO-1 抗體（緊密連接標志物）、Alexa Fluor™488 標記鬼筆環肽（F-actin，細胞骨架）、DAPI（細胞核）染色；Leica DMi8 共聚焦顯微鏡（40× 物鏡）用于熒光強度分析，EVOS M500 熒光顯微鏡（10× 物鏡）用于形態分析，量化細胞數量、F-actin/ZO-1 熒光強度及細胞形態比例。
   
   

• 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）：采用 R&D Systems 試劑盒檢測上清中 IL-6（D6050）、IL-8（DY208）濃度，BioTek Cytation 7 酶標儀定量。
• 乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性實驗：使用 CyQUANT™LDH 檢測試劑盒（C20300），通過重組人 LDH 標準曲線（1pg/mL-5ng/mL）量化上清中 LDH 釋放，反映細胞裂解與死亡程度。
  
  
  

三、核心實驗結果

（一）2D 肺泡上皮 - 成纖維細胞模型對病理機械刺激的響應

1. 增殖無顯著差異

   ：機械刺激后，A549 與 MRC-5 細胞總數與對照組無顯著差異，提示 2D 環境下病理拉伸不促進細胞增殖（圖 3C）。

2. 形態特異性改變

   ：成纖維細胞（MRC-5）在刺激后紡錘形比例顯著升高（81.0±4.0% vs 對照組 26.2±2.7%，p=0.0006），上皮細胞（A549）仍以立方形態為主，無顯著形態轉變（圖 3F）；單培養模型中趨勢一致，成纖維細胞紡錘形比例達 85.7±1.4%（對照組 18.0±1.8%），證實機械刺激對成纖維細胞形態的調控具有細胞類型特異性。

1. F-actin 強度降低

   ：共培養中，A549 與 MRC-5 的 F-actin 熒光強度均顯著低于對照組；單培養中兩種細胞 F-actin 強度同樣降低，但共培養中 A549 的 F-actin 強度顯著高于單培養（p=0.0006），提示上皮 - 成纖維細胞交互可部分代償機械刺激導致的細胞骨架損傷（圖 3D、補充圖 1B）。

2. 緊密連接蛋白 ZO-1 下調

   ：A549 細胞的 ZO-1 熒光強度在共培養與單培養中均顯著降低，且共培養中降低幅度更?。╬=0.01），表明多細胞交互可部分保護上皮屏障功能（圖 3E、補充圖 2C）。炎癥因子與細胞死亡
   
   

1. 細胞死亡加劇

   ：LDH 釋放量顯著高于對照組（圖 3I）；單培養中兩種細胞 LDH 均升高，但組間無顯著差異，提示 2D 環境下機械刺激對兩種細胞的毒性作用相當（補充圖 2E）。

（二）3D 肺泡上皮 - 成纖維細胞共培養模型對病理機械刺激的響應

1. 細胞增殖與形態差異

2. 上皮細胞增殖增加

   ：刺激后 A549 細胞數量顯著升高，MRC-5 數量無顯著變化，與 2D 模型形成對比，證實 3D 環境更易誘導機械刺激介導的上皮細胞增殖（圖 4B）。

3. 成纖維細胞形態反轉

   ：成纖維細胞紡錘形比例顯著降低（34.6±2.8% vs 對照組 61.6±1.8%，p=0.05），更多呈現寬展的肌成纖維細胞樣形態，提示 3D 膠原凝膠環境可能促進成纖維細胞活化（圖 4E）；A549 仍維持立方形態，無顯著變化。

4. 細胞骨架、緊密連接與功能指標

5. F-actin 無顯著變化

   ：與 2D 模型不同，3D 共培養中 A549 與 MRC-5 的 F-actin 強度與對照組無顯著差異，表明 3D 基質可緩沖機械刺激對細胞骨架的破壞（圖 4C）。

6. ZO-1 顯著下調

   ：A549 的 ZO-1 強度降低 45.2%，與 2D 模型一致，證實機械刺激對上皮緊密連接的破壞具有模型通用性（圖 4D）。

7. 炎癥與細胞死亡

   ：IL-8 濃度顯著升高，IL-6 無顯著變化；LDH 釋放顯著增加，且高于 2D 模型（約 50%），提示 3D 環境下細胞對機械刺激的毒性更敏感（圖 4F-H）。

（三）肺泡上皮 - 成纖維細胞類器官模型的發育與機械響應

1. 類器官發育特征

   ：培養 21 天期間，類器官數量隨時間減少（第 3 天 vs 第 9/21 天，p<0.001），面積與直徑顯著增加（第 3 天 vs 第 9/21 天，p<0.001），呈現 “數量減少 - 體積增大" 的成熟趨勢，第 21 天類器官形態穩定，適合機械刺激實驗（圖 5A-D）。

2. 機械刺激后的類器官響應

3. 數量與形態變化

   ：刺激后類器官數量增加 42%，面積減少 43%；成纖維細胞形成 F-actin 陽性胞質突起，破壞類器官球形結構，提示機械刺激誘導細胞向外遷移（圖 5F-G）。

4. 細胞骨架與緊密連接

   ：F-actin 熒光強度顯著升高，且類器官中心區域強度高于周邊（補充圖 3A）；ZO-1 強度顯著降低，且全層（Z 軸）均下調（補充圖 3B），證實機械刺激對類器官細胞骨架的激活與屏障功能的破壞。

5. 炎癥與細胞死亡

   ：IL-6 濃度顯著升高，IL-8 升高但無統計學差異；LDH 釋放顯著增加，與 3D 共培養趨勢一致（圖 5J-L）。

四、研究結論與意義

1. 核心結論

1. 模型特異性響應

   ：病理機械刺激（18%、0.4Hz、24h）對肺泡細胞的調控具有模型依賴性 ——2D 模型抑制細胞骨架、不促進增殖，3D 模型（共培養 / 類器官）誘導上皮增殖、成纖維細胞活化、更強的炎癥與細胞死亡，且類器官能復現細胞空間異質性響應（中心 vs 周邊 F-actin 差異）。

2. 共性損傷效應

   ：所有模型中機械刺激均下調緊密連接蛋白 ZO-1（破壞上皮屏障）、增加炎癥因子（IL-6/IL-8）釋放及細胞死亡，證實機械力失衡是肺部病理的關鍵誘因。

3. 上皮 - 成纖維細胞交互作用

   ：共培養模型中，上皮與成纖維細胞的交互可部分代償機械刺激導致的細胞骨架損傷（2D 中 A549 F-actin 更高）及緊密連接破壞（ZO-1 降低幅度更?。?，凸顯多細胞模型的重要性。

4. 研究意義