細(xì)胞外泌體分離的進(jìn)展

外泌體的分離多采用超速離心、磁珠免疫捕獲、沉淀或過濾幾種方法，這些方法僅適用于前期研究，對于后期工藝放大難以滿足，限制了規(guī)模化生產(chǎn)藥品級外泌體治療產(chǎn)品供臨床使用。致使有效的外泌體提取和外泌體純化工藝技術(shù)成為外泌體治療市場的一個關(guān)鍵技術(shù)阻礙。

鑒于外泌體的多種功能和再生潛力，獲得高產(chǎn)量、高純度和高質(zhì)量的外泌體至關(guān)重要。目前，許多外泌體的分離技術(shù)都是基于它們的生物物理和/或生化特征，如大小、密度和特定表面標(biāo)記而開發(fā)的。但是，由于要求的不同和生物流體的復(fù)雜性，必須仔細(xì)考慮分離技術(shù)的選擇。

1、 超離心（UC）使用100,000 g的離心力來有效地分離小顆粒，如病毒、細(xì)菌和細(xì)胞器UC根據(jù)其主要作用機(jī)制大致可分為三類：差速離心(DC)、等密度梯度離心和速率帶離心(RZC)。UC一直被認(rèn)為是外泌體隔離的“黃金標(biāo)準(zhǔn)"。然而，每種生物流體的復(fù)雜性、特定組成和物理性質(zhì)構(gòu)成了獲得可復(fù)制的純外泌體制劑的技術(shù)障礙。

a、差速離心這項技術(shù)依賴于通過沉降沉淀法對顆粒進(jìn)行順序分離，這取決于顆粒的大小和密度，通過使用一系列離心力和持續(xù)時間。DC通過300至100,000 g的離心力進(jìn)行多次離心循環(huán)，通過控制不同的離心力和離心次數(shù)，依次去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片和凋亡小體。最后一次離心(即100,000 g)后，通過去除上清來收集外泌體。然而，差速離心法有一些局限性，例如耗時，需要昂貴的設(shè)備，操作繁瑣，并且在過高的轉(zhuǎn)速下破壞外泌體的完整性。此外，一些脂蛋白可以與外泌體共沉淀因此，我們提出了密度梯度離心法來提高外泌體的純度。

b、使用兩種類型的密度梯度超離心：等重超離心和RZC。DC經(jīng)常遭受污染和外泌體損失，因為外泌體的不均勻性和細(xì)胞外囊泡大小有相當(dāng)大的重疊。UC通常與等滲或RZC技術(shù)相結(jié)合，以允許相對低密度的外泌體懸浮以進(jìn)一步凈化。該技術(shù)還可以提高外泌體的分離量。典型的密度梯度UC包括以下步驟:首先，將覆蓋樣品顆粒密度范圍的具有不同密度的生物相容性介質(zhì)層(例如，碘二醇或蔗糖)放入管中，從底部到頂部密度逐漸降低。然后將感興趣的樣品添加到密度梯度介質(zhì)的頂部，然后延長離心時間(例如，100,000 g離心16小時)。與普通UC相比，密度梯度離心可有效提高外泌體的純度，例如，用密度梯度離心法從豬骨髓中分離骨髓細(xì)胞然而，蔗糖-密度梯度UC分離過程耗時長，需要大量的生物樣品，回收率較低。Kuipers等人發(fā)現(xiàn)，對于小密度梯度的離心過程，碘沙醇比蔗糖更適合使用，因為在碘沙醇梯度中，外泌體可以以相對更快的速度達(dá)到平衡。因此，可以通過選擇合適的惰性介質(zhì)來優(yōu)化外泌體的分離，從而提高分離效果。

1. 超濾UF是一種基于物質(zhì)大小的分離方法，利用具有不同分子量截止點(MWCO)的膜分離外泌體，通常與其他方法聯(lián)合使用進(jìn)行進(jìn)一步純化。與UC相比，UF增加了囊泡隔離，顯著縮短了處理時間，提高了吞吐量，但不需要特殊設(shè)備。但由于剪切力的作用，UF容易發(fā)生開裂和變形，造成外泌體的損失。

基于超濾原理，導(dǎo)出了切向流過濾和順序過濾方法。在TFF模式下，樣品流體沿平行于膜的方向進(jìn)入，調(diào)節(jié)了膜間壓力，減少了外泌體的損失和膜的堵塞，延長了膜的使用壽命。TFF在吞吐量、再現(xiàn)性、時間、成本和可擴(kuò)展性方面都超過了UC。

2.順序過濾是另一種常用的方法，其中樣品首先通過1000 nm的過濾器去除細(xì)胞碎片和凋亡囊泡，然后通過500-kD MWCO的第二個過濾器去除TFF中的游離蛋白。最后，50 - 200nm直徑的材料可以通過200nm的過濾器進(jìn)行隔離。該方法具有溫和、自動化、適合大顆粒的優(yōu)點，可用于生產(chǎn)尺寸均勻的外泌體，在很大程度上保證了外泌體的完整性和純度。

為了克服傳統(tǒng)過濾的局限性，Chernyshev等人開發(fā)了不對稱深度過濾(DF)，作為一種容易獲得的方法，具有高收率和低外泌體污染。常規(guī)過濾一般分為表面過濾和DF過濾。

在表面過濾過程中，大顆粒由于其尺寸而被保留，這些顆粒最終會在過濾介質(zhì)表面形成一個“餅"，而對于DF介質(zhì)，大空隙允許顆粒進(jìn)入介質(zhì)的孔隙。因此，不對稱DF方法的原理是，當(dāng)外泌體固定在多孔介質(zhì)表面和深度內(nèi)時，小顆粒可以被洗脫。該方法適用于從用于培養(yǎng)ev分泌細(xì)胞的大量培養(yǎng)基中分離治療性外泌體。

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